Футбольную карьеру Глушаков начал в местной ДЮСШ Миллерово, куда его привела бабушка. С 1998 года благодаря своему дяде по матери Валерию Глушакову он начал заниматься в Детско-юношеской спортивной школе ПФК ЦСКА. У своего дяди Денис первоначально и проживал, а потом переехал в футбольный интернат, где некоторое время жил в одной комнате с Сосланом Джанаевым. В 1999 году, перестав попадать в основной состав ЦСКА, перешёл в «Нику», где играл вплоть до 2005 года.

Позже был замечен селекционерами московского «Локомотива» и принял предложение играть за дубль команды. В 2007 году был отдан в аренду иркутской «Звезде», за которую провёл 34 матча и забил 8 мячей. 13 июля 2008 года в матче «Динамо» — «Локомотив» впервые провёл на поле все 90 минут в составе основной команды «Локомотива». 27 июля 2008 года в матче с «Москвой» забил свой первый мяч в Премьер-лиге. В той же игре был признан лучшим игроком матча, после чего стал регулярно играть в основе. В конце сезона был признан лучшим игроком сезона по версии болельщиков. Набрал 24 % голосов и опередил Сергея Гуренко и Дмитрия Торбинского. Постепенно полузащитник стал одним из основных игроков «Локомотива» и лидером команды, особенно удачным для него вышел сезон 2011/2012, а в 2012 году стал капитаном команды. В марте 2011 года продлил соглашение с командой на 4,5 года. После завершения первой части чемпионата удостоился звания «Игрок года».

18 июня 2013 года ФК «Спартак» официально подтвердил трансфер Глушакова и объявил о подписании контракта с полузащитником сборной России. Сумма трансфера составила около 8 млн долларов. Палата по разрешению споров РФС постановила, что «Локомотив» обязан выплатить «Нике» компенсацию в 15 % от сделки за переход хавбека в «Спартак» летом 2013 года, а последовавшая апелляция «железнодорожников» (считавших, что игрок в 2006 году в качестве свободного агента совершил свой первый переход в ростовский СКА) и рассмотрение дела в спортивном арбитражном суде в Лозанне признали правоту «Ники».

16 июля 2013 года дебютировал в составе «Спартака» в чемпионате России в гостевом матче против «Крыльев Советов». В первом тайме принял участие в первом голе, сделав проникающую передачу в штрафную на Сергея Паршивлюка, после паса которого другой новичок команды Тино Коста открыл счёт. Первый гол за «Спартак» Глушаков забил 10 ноября 2013 года, когда установил окончательный счёт в победном матче чемпионата России против «Зенита» (4:2).

21 июля 2016 года футболисты и тренеры «Спартака» выбрали Глушакова новым капитаном команды. 7 мая 2017 года Глушаков вместе со «Спартаком» стал чемпионом России; Денис посвятил чемпионство своему дяде, умершему за 40 дней до этого. Для самого Дениса сезон стал одним из лучших в карьере: он был безоговорочным лидером команды и по итогам сезона был признан РФС лучшим игроком года. В 2017 году вручена Премия GQ в номинации «Спортсмен года». 17 октября в матче Лиги чемпионов против испанской «Севильи» Денис забил гол.